Hervorrufung von Apoptose in B16-BL6-Melanom-Zellen nach Exposition bei elektromagnetischen Feldern, modelliert nach interzellulären Kalzium-Wellen.

Ein dynamisches elektromagnetisches Feld (EMF) ist ein sich ausbreitendes Kraftfeld, das zeitliche Schwankungen in Intensität und Richtung aufweist. Im Laufe des letzten Jahrhunderts wurden große Anstrengungen unternommen, um künstliche EMF zu erzeugen, die den natürlich vorkommenden EMF nachempfunden sind. Die Modellierung der Intensitäten und zeitlichen Signaturen der natürlichen EMF-Umgebung in einem künstlichen Feld ermöglicht die Erzeugung von Mustern, die von denen biologischer Systeme nicht zu unterscheiden sind. Die Kalzium-Signalübertragung ist eine Form der zellulären Kommunikation, die für die Entwicklung, Erhaltung und Ausbreitung vieler biologischer Systeme von wesentlicher Bedeutung ist. Dieser Prozess ermöglicht es benachbarten Zellen, miteinander zu kommunizieren und dem gesamten System, mit seiner Umgebung zu kommunizieren. Eine der ausgeprägtesten Formen der Kalzium-Signalübertragung sind interzelluläre Kalziumwellen (ICW). Interzelluläre Kalziumwellen sind natürlich vorkommende physiologische Prozesse, die mit einem Anstieg von Ca2+ innerhalb einer Zelle beginnen, der sich wellenförmig auf benachbarte Zellen ausbreitet. Eine Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+] beeinflusst die Dauer und Intensität der Ca2+-Welle. Veränderungen des intrazellulären Ca2+ erfolgen durch die Öffnung von spannungs- und ligandengesteuerten Ca2+-Kanälen, die einen Fluss von Ca2+ durch die Plasmamembran ermöglichen, oder durch die Freisetzung von Ca2+ aus internen Reserven wie dem endoplasmatischen Retikulum. Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle (VGCC) sind Ca2+-durchlässige Ionenkanäle, die sich an der Plasmamembran einer Zelle befinden. Es gibt drei Hauptkategorien von VGCC: mit niedriger Spannung aktivierte (T-Typ), mit hoher/mittlerer Spannung aktivierte (P/R-Typ) und mit hoher Spannung aktivierte (L-Typ). Der Einstrom von Ca2+ durch VGCC ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung, die Vermehrung und die Apoptose einer Zelle; daher ist die ordnungsgemäße Funktion dieser Kanäle für die zelluläre Homöostase erforderlich. B16-BL6-Zellen (aus Mäusemelanomtumoren) dienen aufgrund der hohen Prävalenz von spannungsgesteuerten Ca2+-Kanälen vom T-Typ als geeignetes Modell für Ca2+-Wellen, während HEK293-Zellen nur sehr geringe Mengen an T-Typ-Kanälen aufweisen. Frühere Studien haben die Fähigkeit spezifischer gemusterter EMF zur Beeinflussung von T-Typ-Calciumkanälen gezeigt, die mit der Hemmung der Proliferation bösartiger Zellen in Zusammenhang stehen. Die Hypothese der Autoren war, dass ein nach ICW gemustertes EMF die Zahl der lebensfähigen B16-BL6-Zellen verringern und die Apoptose fördern würde.

B16-BL6- und HEK293T-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen und auf 100 mm Kulturplatten kultiviert. Für die Experimente wurden die Zellen geerntet und etwa 200 000 Zellen in eine 60-mm-Versuchsplatte gegeben und vor den Behandlungen über Nacht kultiviert. Für einige Experimente wurden die Zellen unmittelbar vor der Schein- oder EMF-Exposition mit BAY K8644, einem VGCC-Aktivator, behandelt. Die Versuchsplatten (Ca-EMF oder Sinus-EMF) wurden in der Mitte eines Feldgenerators platziert. Das EMF wurde für 40 Minuten angelegt. Nach der Exposition wurden die Zellen für 48 Stunden in den Inkubator zurückgebracht.

Das in dieser Studie verwendete Ca-EMF wurde dem physiologischen Aktivierungsmuster von Kalziumwellen in Mäusezellen nachempfunden, das etwa 23 Spannungsspitzen in einem Zeitraum von 5 Sekunden aufweist. Das Muster des EMF wurde nach einer von Hennig durchgeführten Studie modelliert, in der die intra- und interzelluläre Kalziumwellenaktivität aufgezeichnet wurde (Sequenz von 500 aufgezeichneten Punkten). Aus diesen Aufzeichnungen wurde ein Diagramm erstellt, das die relativen Amplituden der Kalziumwellenaktivität anzeigt. Das sich daraus ergebende Muster dieses Diagramms wurde verwendet, um ein EMF mit identischen Amplituden-, Frequenz- und Zeitmerkmalen wie eine natürlich vorkommende Kalziumwelle zu erzeugen. Das EMF wurde mit einem Digital-Analog-Gerät erzeugt. Alle in dieser Studie verwendeten EMF wurden mit einer Intensität von 1 Mikrotesla emittiert, was mit den Intensitäten zahlreicher biomolekularer Signalwege übereinstimmt. 48 Stunden nach der Behandlung wurden die Zellen geerntet und mit einem Standard-Neubauer-Hämozytometer und einem inversen Phasenkontrastmikroskop gezählt. Alle Zellen wurden vor der Aufnahme 15 Minuten lang mit Acridinorange und Ethidiumbromid behandelt. Die Bilder wurden mit einem inversen Zeiss Axiovert 200 M Zoom-Mikroskop unter Verwendung der Bearbeitungssoftware ZEN 3.5 Blue Edition aufgenommen.

Es wurde ein signifikanter Effekt zwischen den drei Behandlungsbedingungen (kein EMF, Sinus-EMF, Ca2+ EMF) und der Anzahl der gezählten lebensfähigen Zellen festgestellt. Ein t-Test für unabhängige Stichproben ergab, dass die Zellen, die der Ca2+ EMF-Bedingung ausgesetzt waren, signifikant weniger lebensfähige Zellen aufwiesen (-50,3 %) im Vergleich zu der Bedingung ohne EMF (p = 0,006).
Die einmalige Exposition von B16-BL6-Zellen mit Sinus-EMF für 40 Minuten erhöhte die Anzahl der lebensfähigen Zellen um 40% im Vergleich zur Kontrolle.
Bei den B16-BL6-Zellen, die den Kalziumaktivator BAY K8644 erhielten, war die Wirkung beider EMF-Arten stark vermindert, und es gab keinen signifikanten Unterschied in der Zahl der lebensfähigen Zellen im Vergleich zur Kontrolle.
Darüber hinaus gab es keine signifikanten Auswirkungen auf lebensfähige Zellen, nicht lebensfähige Zellen oder Gesamtzellen, wenn die HEK293-Zelllinie verwendet wurde.
Die Zellbildgebung mit Acridinorange und Ethidiumbromid-Farbstoff zeigte im Vergleich zur Kontrollbedingung eine erhebliche zelluläre Apoptose, präapoptotische Zellen, Kernfragmentierung und große Abstände zwischen den Zellen unter der Ca2+ EMF-Bedingung.

Dies ist das erste bekannte Experiment, bei dem ein komplexes EMF verwendet wurde, das dem physiologischen Feuern von interzellulären Kalziumwellen nachempfunden ist. Die Ergebnisse zeigen, dass ein dynamisches, physiologisch gemustertes EMF die Vermehrung bösartiger Zellen hemmt und den Zelltod auslösen kann. Eine einzige Exposition mit dem Ca2+-modellierten EMF führte zu einem signifikanten Rückgang der durchschnittlichen Anzahl lebensfähiger Zellen um 50,3 %. Der vorgeschlagene Wirkmechanismus für dieses EMF mit spezifischer Frequenz umfasst die Erhöhung der Präsenz reaktiver Sauerstoffspezies, die unterschiedliche Aktivierung zellulärer Signalkaskaden und die Induktion eines schnellen Ca2+-Einstroms, die alle das Zellwachstum verringern und die Apoptose auslösen sollen. Zellen, die mit dem BAY K8644-Aktivator behandelt und dem Ca2+-EMF ausgesetzt wurden, zeigten keine signifikante Abnahme der durchschnittlichen Anzahl lebensfähiger Zellen im Vergleich zu den Gruppen ohne EMF und BAY K8644 + ohne EMF. Der Kalziumaktivator BAY K8644 ist ein spannungsabhängiger L-Typ-Kalziumkanal-Agonist, der die Permeabilität des Ca2+-Kanals erhöht, was zu einem kurzen Ca2+-Einstrom führt. Die Fähigkeit von BAY K8644, die Wirkungen von Ca2+-EMF zu hemmen, deutet darauf hin, dass die Wirksamkeit des Feldes in seiner Fähigkeit liegt, die kinetischen Eigenschaften von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen vom L- und T-Typ zu verändern. Außerdem ist das Ausbleiben einer Wirkung bei HEK293-Zellen von Bedeutung. Dies ist ein starkes Indiz für die Spezifität des Ca2+-EMF-Mechanismus. Krebs ist eine direkte Folge von Veränderungen in den Mechanismen, die für die Vermehrung und den Tod einer Zelle verantwortlich sind. Da die Ca2+-Signalübertragung für beide Prozesse entscheidend ist, kann die Bedeutung der Ca2+-Flüsse innerhalb und zwischen Zellen nicht hoch genug eingeschätzt werden. Die abnorme Ca2+-Signalübertragung in bösartigen Zellen erfolgt durch die Veränderung und unterschiedliche Expression von Ca2+-Kanälen und -Pumpen. Da die Verabreichung des Aktivators die Wirkungen des Ca2+-EMF unterdrückte, wird angenommen, dass das Feld durch eine Erhöhung der Durchlässigkeit der T-Typ-Ca2+-Kanäle wirkt und so einen allmählichen Ca2+-Einstrom über den 40-minütigen Expositionszeitraum ermöglicht. Die konkurrierende Wirkung des Aktivators BAY K 8644 könnte die normale Ca2+-Signalisierung der bösartigen Zellen durch veränderte L-Typ-Kanäle fördern, während das Ca2+-EMF eine unregelmäßige, gestörte Signalisierung durch T-Typ-Kanäle bewirkt. Die Autoren schlagen vor, dass diese beiden konkurrierenden Wirkungen zu erheblichen Interferenzen führen, wobei die verbleibende Wirkung vernachlässigbar ist. Die Fähigkeit von Ca2+-EMF, die Vermehrung und das Überleben bösartiger Zellen zu beeinflussen, deutet darauf hin, dass die Exposition gegenüber spezifischen EMF als potenzielle Krebstherapie dienen könnte. Beachtliche mögliche medizinische oder auch militärische Anwendungsbereiche ergeben sich im Zuge des zu erwartenden Paradigmenwechsels „EMF-Signal steuert Biologie“ (Anm. der Redaktion). (AT)